Sababu za kuingilia katika athari za PCR

Wakati wa majibu ya PCR, sababu zingine za kuingilia mara nyingi hukutana.
Kwa sababu ya unyeti mkubwa sana wa PCR, uchafu unachukuliwa kuwa moja ya sababu muhimu zinazoathiri matokeo ya PCR na inaweza kutoa matokeo chanya ya uwongo.
Vile vile muhimu ni vyanzo anuwai ambavyo husababisha matokeo ya uwongo. Ikiwa sehemu moja au zaidi ya mchanganyiko wa PCR au athari ya ukuzaji yenyewe imezuiliwa au kuingiliwa na, assay ya utambuzi inaweza kuzuiliwa. Hii inaweza kusababisha kupunguzwa kwa ufanisi na hata matokeo mabaya ya uwongo.
Mbali na kizuizi, upotezaji wa uadilifu wa asidi ya kiini inaweza kutokea kwa sababu ya usafirishaji na/au hali ya uhifadhi kabla ya utayarishaji wa sampuli. Hasa, joto la juu au uhifadhi duni unaweza kusababisha uharibifu wa seli na asidi ya kiini. Urekebishaji wa seli na tishu na kuingiza mafuta ya taa ni sababu zinazojulikana za kugawanyika kwa DNA na shida inayoendelea (ona Mchoro 1 na 2). Katika visa hivi, hata kutengwa bora na utakaso hautasaidia.

Kielelezo 1 | Athari za uhamishaji juu ya uadilifu wa DNA
Electrophoresis ya Agarose Gel ilionyesha kuwa ubora wa DNA uliyotengwa na sehemu za mafuta ya taa ya taa ya taa ilitofautiana sana. DNA ya urefu tofauti wa vipande vya wastani ulikuwepo kwenye dondoo kulingana na njia ya urekebishaji. DNA ilihifadhiwa tu wakati imewekwa katika sampuli za asili za waliohifadhiwa na katika buffered neutral formalin. Matumizi ya marekebisho ya bouin ya asidi au isiyo na asidi, asidi iliyo na asidi iliyo na asidi ilisababisha upotezaji mkubwa wa DNA. Sehemu iliyobaki imegawanyika sana.
Upande wa kushoto, urefu wa vipande huonyeshwa kwa jozi za kilobase (KBP)

Kielelezo 2 | Upotezaji wa uadilifu wa malengo ya asidi ya kiini
(a) Pengo la 3'-5 ′ kwenye kamba zote mbili zitasababisha mapumziko katika lengo la DNA. Mchanganyiko wa DNA bado utatokea kwenye kipande kidogo. Walakini, ikiwa tovuti ya annealing ya primer haipo kwenye kipande cha DNA, ukuzaji tu wa mstari hufanyika. Katika hali nzuri zaidi, vipande vinaweza kurekebisha kila mmoja, lakini mavuno yatakuwa ndogo na chini ya viwango vya kugundua.
(B) Kupoteza besi, haswa kwa sababu ya malezi na malezi ya thymidine, husababisha kupungua kwa idadi ya vifungo vya H na kupungua kwa TM. Wakati wa awamu ya joto iliyoinuliwa, primers zitayeyuka mbali na DNA ya matrix na hazitaweza hata chini ya hali ngumu.
(c) Misingi ya karibu ya thymine huunda TT dimer.
Shida nyingine ya kawaida ambayo mara nyingi hufanyika katika utambuzi wa Masi ni kutolewa chini ya-bora kwa asidi ya kiini cha lengo ikilinganishwa na uchimbaji wa phenol-chloroform. Katika hali mbaya, hii inaweza kuhusishwa na hasi za uwongo. Muda mwingi unaweza kuokolewa kwa kuchemsha lysis au digestion ya enzymatic ya uchafu wa seli, lakini njia hii mara nyingi husababisha unyeti wa chini wa PCR kwa sababu ya kutolewa kwa asidi ya kiini.

Uzuiaji wa shughuli za polymerase wakati wa kukuza

Kwa ujumla, kizuizi hutumiwa kama dhana ya chombo kuelezea mambo yote ambayo husababisha matokeo ya PCR. Kwa maana madhubuti ya biochemical, kizuizi ni mdogo kwa shughuli ya enzyme, yaani, inapunguza au kuzuia ubadilishaji wa bidhaa ndogo kupitia mwingiliano na tovuti inayotumika ya polymerase ya DNA au cofactor yake (EG, Mg2+ kwa polymerase ya Taq).
Vipengele katika sampuli au buffers anuwai na dondoo zilizo na reagents zinaweza kuzuia moja kwa moja enzyme au mtego wa cofactors yake (kwa mfano EDTA), na hivyo inasababisha polymerase na kwa upande wake kusababisha matokeo ya PCR iliyopungua au ya uwongo.
Walakini, maingiliano mengi kati ya vifaa vya athari na asidi ya kiini inayolenga pia huteuliwa kama 'PCR inhibitors'. Mara tu uadilifu wa seli ukisumbuliwa na kutengwa na asidi ya kiini inatolewa, mwingiliano kati ya sampuli na suluhisho lake linalozunguka na sehemu thabiti inaweza kutokea. Kwa mfano, 'scavenger' inaweza kufunga DNA moja au mbili-zilizo na waya kupitia mwingiliano usio na ushirikiano na kuingilia kati na kutengwa na utakaso kwa kupunguza idadi ya malengo ambayo hatimaye hufikia chombo cha athari ya PCR.
Kwa ujumla, vizuizi vya PCR vipo katika maji mengi ya mwili na vitu vingi vinavyotumika kwa vipimo vya utambuzi wa kliniki (urea katika mkojo, hemoglobin na heparini katika damu), virutubisho vya lishe (vifaa vya kikaboni, glycogen, mafuta, ions za Ca2) na vifaa katika mazingira (phenols, metali nzito)

Vizuizi vilivyoenea zaidi vya PCR vinaweza kupatikana katika seli za bakteria na eukaryotic, DNA isiyolengwa, macromolecule ya DNA ya matawi ya tishu na vifaa vya maabara kama vile glavu na plastiki. Utakaso wa asidi ya kiini wakati au baada ya uchimbaji ni njia inayopendelea ya kuondoa vizuizi vya PCR.
Leo, vifaa anuwai vya uchimbaji wa kiotomatiki vinaweza kuchukua nafasi ya itifaki nyingi za mwongozo, lakini ahueni ya 100% na/au utakaso wa malengo haujawahi kupatikana. Vizuizi vinavyowezekana bado vinaweza kuwapo katika asidi ya kiini iliyosafishwa au inaweza kuwa tayari imeanza. Mikakati tofauti zipo ili kupunguza athari za vizuizi. Chaguo la polymerase inayofaa inaweza kuwa na athari kubwa kwa shughuli za inhibitor. Njia zingine zilizothibitishwa za kupunguza kizuizi cha PCR ni kuongeza mkusanyiko wa polymerase au kutumia nyongeza kama BSA.
Uzuiaji wa athari za PCR unaweza kuonyeshwa na utumiaji wa udhibiti wa ubora wa mchakato wa ndani (IPC).
Utunzaji lazima uchukuliwe ili kuondoa vitendaji vyote na suluhisho zingine kwenye kitengo cha uchimbaji, kama vile ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol na phenol, kutoka kwa asidi ya kiini hujitenga na hatua kamili ya kuosha. Kulingana na mkusanyiko wao, wanaweza kuamsha au kuzuia PCR.