Sababu za kuingiliwa katika athari za PCR

Wakati wa mmenyuko wa PCR, baadhi ya sababu zinazoingilia mara nyingi hukutana.
Kutokana na unyeti mkubwa sana wa PCR, uchafuzi unachukuliwa kuwa mojawapo ya mambo muhimu zaidi yanayoathiri matokeo ya PCR na inaweza kutoa matokeo mazuri ya uongo.
Vile vile muhimu ni vyanzo mbalimbali vinavyosababisha matokeo ya uwongo-hasi. Ikiwa sehemu moja au zaidi muhimu ya mchanganyiko wa PCR au mmenyuko wa ukuzaji yenyewe umezuiwa au kuingiliwa, uchunguzi wa uchunguzi unaweza kuzuiwa. Hii inaweza kusababisha kupungua kwa ufanisi na hata matokeo mabaya ya uongo.
Mbali na kuzuiwa, kupoteza uadilifu lengwa wa asidi nucleiki kunaweza kutokea kutokana na usafirishaji na/au hali ya kuhifadhi kabla ya kutayarisha sampuli. Hasa, joto la juu au hifadhi isiyofaa inaweza kusababisha uharibifu wa seli na asidi ya nucleic. Uwekaji wa seli na tishu na upachikaji wa mafuta ya taa ni sababu zinazojulikana za kugawanyika kwa DNA na tatizo linaloendelea (ona Mchoro 1 na 2). Katika kesi hizi, hata kutengwa na utakaso bora hautasaidia.

Kielelezo 1 | Madhara ya kutohamasishwa kwenye uadilifu wa DNA
Electrophoresis ya jeli ya Agarose ilionyesha kuwa ubora wa DNA iliyotengwa na sehemu za uchunguzi wa maiti za mafuta ya taa ulitofautiana sana. DNA ya urefu tofauti wa wastani wa kipande ilikuwepo kwenye dondoo kulingana na njia ya kurekebisha. DNA ilihifadhiwa tu wakati iliwekwa katika sampuli za asili zilizogandishwa na katika formalin ya upande wowote iliyoakibishwa. Utumiaji wa kirekebishaji cha Bouin chenye tindikali sana au kisicho na buffered, formalin iliyo na asidi ilisababisha upotevu mkubwa wa DNA. Sehemu iliyobaki imegawanyika sana.
Upande wa kushoto, urefu wa vipande unaonyeshwa kwa jozi za kilobase (kbp)

Kielelezo 2 | Kupoteza uadilifu wa malengo ya asidi ya nucleic
(a) Pengo la 3′-5′ kwenye nyuzi zote mbili litasababisha kukatika kwa DNA inayolengwa. usanisi wa DNA bado utatokea kwenye kipande kidogo. Hata hivyo, ikiwa tovuti ya utangulizi ya utangulizi haipo kwenye kipande cha DNA, upanuzi wa mstari pekee hutokea. Katika hali nzuri zaidi, vipande vinaweza kujaa kila mmoja, lakini mavuno yatakuwa ndogo na chini ya viwango vya kugundua.
(b) Kupoteza besi, hasa kutokana na uharibifu na uundaji wa dimer ya thymidine, husababisha kupungua kwa idadi ya vifungo vya H na kupungua kwa Tm. Wakati wa awamu ya ongezeko la joto, vianzio vitayeyuka kutoka kwa DNA ya matriki na haitachuja hata chini ya hali ngumu kidogo.
(c) Misingi ya thymine iliyo karibu huunda dimer ya TT.
Tatizo lingine la kawaida ambalo mara nyingi hutokea katika uchunguzi wa molekuli ni kutolewa chini ya mojawapo ya asidi ya nucleic lengwa ikilinganishwa na uchimbaji wa phenol-chloroform. Katika hali mbaya, hii inaweza kuhusishwa na hasi za uwongo. Muda mwingi unaweza kuokolewa kwa kuchemsha lisisi au usagaji wa enzymatic wa uchafu wa seli, lakini njia hii mara nyingi husababisha unyeti mdogo wa PCR kutokana na kutolewa kwa asidi ya nucleic ya kutosha.

Uzuiaji wa shughuli za polymerase wakati wa kukuza

Kwa ujumla, kizuizi kinatumika kama dhana ya kontena kuelezea mambo yote ambayo husababisha matokeo ya PCR ya chini kabisa. Kwa maana madhubuti ya kibayolojia, kizuizi ni mdogo kwa shughuli ya kimeng'enya, yaani, inapunguza au kuzuia ubadilishaji wa bidhaa ndogo kupitia mwingiliano na tovuti hai ya polimerasi ya DNA au cofactor yake (kwa mfano, Mg2+ kwa Taq DNA polymerase).
Vipengele katika sampuli au vihifadhi mbalimbali na dondoo zilizo na vitendanishi vinaweza kuzuia kimeng'enya moja kwa moja au kunasa viambata vyake (km EDTA), na hivyo kuzima polimerasi na hivyo kusababisha kupungua au matokeo hasi ya PCR.
Hata hivyo, mwingiliano mwingi kati ya vijenzi vya athari na asidi nucleiki iliyo na lengwa pia huteuliwa kuwa 'vizuizi vya PCR'. Mara tu uadilifu wa seli unapovunjwa na kutengwa na asidi ya nucleic inatolewa, mwingiliano kati ya sampuli na ufumbuzi wake unaozunguka na awamu imara inaweza kutokea. Kwa mfano, 'watakasaji' wanaweza kuunganisha DNA iliyo na nyuzi moja au mbili kupitia mwingiliano usio na ushirikiano na kuingilia kati kutengwa na utakaso kwa kupunguza idadi ya shabaha ambazo hatimaye hufikia chombo cha athari cha PCR.
Kwa ujumla, vizuizi vya PCR vipo katika vimiminika vingi vya mwili na vitendanishi vinavyotumika kwa ajili ya uchunguzi wa kimatibabu (urea katika mkojo, hemoglobini na heparini katika damu), virutubisho vya chakula (vijenzi vya kikaboni, glycogen, mafuta, Ca2+ ioni) na vipengele katika mazingira (phenoli). , metali nzito)

Vizuizi vya PCR vilivyoenea zaidi vinaweza kupatikana katika bakteria na seli za yukariyoti, DNA isiyolengwa, molekuli kuu zinazofunga DNA za matrices ya tishu na vifaa vya maabara kama vile glavu na plastiki. Utakaso wa asidi nucleic wakati au baada ya uchimbaji ni njia inayopendekezwa ya kuondoa vizuizi vya PCR.
Leo, vifaa mbalimbali vya uchimbaji wa otomatiki vinaweza kuchukua nafasi ya itifaki nyingi za mwongozo, lakini urejeshaji wa 100% na / au utakaso wa malengo haujawahi kupatikana. Vizuizi vinavyowezekana bado vinaweza kuwa katika asidi ya nukleiki iliyosafishwa au tayari vimeanza kutumika. Mikakati tofauti ipo ili kupunguza athari za vizuizi. Uchaguzi wa polimasi inayofaa inaweza kuwa na athari kubwa kwa shughuli ya kizuizi. Njia zingine zilizothibitishwa za kupunguza kizuizi cha PCR ni kuongeza mkusanyiko wa polimerasi au kutumia viungio kama vile BSA.
Uzuiaji wa athari za PCR unaweza kuonyeshwa kwa matumizi ya udhibiti wa ubora wa mchakato wa ndani (IPC).
Tahadhari lazima ichukuliwe ili kuondoa vitendanishi vyote na miyeyusho mingine kwenye kifurushi cha uchimbaji, kama vile ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol na phenoli, jitenga na asidi nucleic kwa hatua ya kuosha kabisa. Kulingana na mkusanyiko wao, wanaweza kuamsha au kuzuia PCR.