Vipengele vya kuingilia kati katika athari za PCR

Wakati wa mmenyuko wa PCR, mambo kadhaa yanayoingilia kati mara nyingi hukutana.
Kutokana na unyeti mkubwa wa PCR, uchafuzi unachukuliwa kuwa mojawapo ya mambo muhimu zaidi yanayoathiri matokeo ya PCR na unaweza kutoa matokeo chanya ya uongo.
Vyanzo mbalimbali vinavyosababisha matokeo hasi ya uwongo pia ni muhimu. Ikiwa sehemu moja au zaidi muhimu ya mchanganyiko wa PCR au mmenyuko wa ukuzaji yenyewe utazuiwa au kuingiliwa, kipimo cha utambuzi kinaweza kuzuiwa. Hii inaweza kusababisha ufanisi mdogo na hata matokeo hasi ya uwongo.
Mbali na kizuizi, upotevu wa uadilifu wa asidi ya kiini lengwa unaweza kutokea kutokana na hali ya usafirishaji na/au uhifadhi kabla ya utayarishaji wa sampuli. Hasa, halijoto ya juu au hifadhi isiyotosha inaweza kusababisha uharibifu wa seli na asidi ya kiini. Kujibandika kwa seli na tishu na kupachika mafuta ya taa ni sababu zinazojulikana za kugawanyika kwa DNA na tatizo linaloendelea (tazama Mchoro 1 na 2). Katika visa hivi, hata kutengwa na utakaso bora hautasaidia.

Mchoro 1 | Athari ya kuzuiwa kwa uadilifu wa DNA
Electrophoresis ya jeli ya Agarose ilionyesha kuwa ubora wa DNA iliyotengwa kutoka kwa sehemu za mafuta ya taa za uchunguzi wa maiti ulitofautiana sana. DNA ya urefu tofauti wa vipande vya wastani ilikuwepo kwenye dondoo kulingana na mbinu ya urekebishaji. DNA ilihifadhiwa tu ikiwa imewekwa katika sampuli asilia zilizogandishwa na katika formalin isiyo na sehemu iliyohifadhiwa. Matumizi ya formalin yenye asidi kali ya Bouin au isiyo na sehemu iliyo na sehemu iliyo na asidi ya fomik ilisababisha upotevu mkubwa wa DNA. Sehemu iliyobaki imegawanyika sana.
Upande wa kushoto, urefu wa vipande umeonyeshwa katika jozi za kilobase (kbp)

Mchoro 2 | Kupotea kwa uadilifu wa shabaha za asidi ya kiini
(a) Pengo la 3′-5′ kwenye nyuzi zote mbili litasababisha kuvunjika kwa DNA inayolengwa. Usanisi wa DNA bado utatokea kwenye kipande kidogo. Hata hivyo, ikiwa sehemu ya kunyonya ya primer haipo kwenye kipande cha DNA, ukuzaji wa mstari pekee hutokea. Katika hali nzuri zaidi, vipande vinaweza kujaa tena, lakini mavuno yatakuwa madogo na chini ya viwango vya kugundua.
(b) Kupotea kwa besi, hasa kutokana na kuondoa uchafu na uundaji wa thymidine dimer, husababisha kupungua kwa idadi ya vifungo vya H na kupungua kwa Tm. Wakati wa awamu ya kupasha joto iliyorefushwa, primers huyeyuka kutoka kwa DNA ya matrix na hazitapungua hata chini ya hali ngumu kidogo.
(c) Besi za thimini zilizo karibu huunda kipimajoto cha TT.
Tatizo jingine la kawaida ambalo mara nyingi hutokea katika uchunguzi wa molekuli ni kutolewa kidogo kuliko kiwango bora cha asidi lengwa ya kiini ikilinganishwa na uchimbaji wa fenoli-klorofomu. Katika hali mbaya zaidi, hii inaweza kuhusishwa na hasi zisizo sahihi. Muda mwingi unaweza kuokolewa kwa kuchemsha kwa lysis au usagaji wa kimeng'enya wa uchafu wa seli, lakini njia hii mara nyingi husababisha unyeti mdogo wa PCR kutokana na kutolewa kwa asidi ya kiini haitoshi.

Kuzuia shughuli za polima wakati wa ukuzaji

Kwa ujumla, kizuizi hutumika kama dhana ya chombo kuelezea mambo yote yanayosababisha matokeo duni ya PCR. Kwa maana ya kibiokemikali pekee, kizuizi hicho kimepunguzwa kwa shughuli ya kimeng'enya, yaani, hupunguza au kuzuia ubadilishaji wa bidhaa ya substrate kupitia mwingiliano na eneo linalofanya kazi la polimerasi ya DNA au kitendanishi chake (km, Mg2+ kwa polimerasi ya Taq DNA).
Vipengele katika sampuli au bafa na dondoo mbalimbali zenye vitendanishi vinaweza kuzuia moja kwa moja kimeng'enya au kunasa vitendanishi vyake (km EDTA), na hivyo kuzima polima na kusababisha matokeo hasi ya PCR yaliyopungua au ya uwongo.
Hata hivyo, mwingiliano mwingi kati ya vipengele vya mmenyuko na asidi za kiini zenye shabaha pia huteuliwa kama 'vizuizi vya PCR'. Mara tu uadilifu wa seli unapovurugwa na kutengwa na asidi ya kiini kutolewa, mwingiliano kati ya sampuli na myeyusho wake unaozunguka na awamu thabiti unaweza kutokea. Kwa mfano, 'watapeli' wanaweza kufunga DNA yenye nyuzi moja au mbili kupitia mwingiliano usio wa kovalenti na kuingiliana na kutengwa na utakaso kwa kupunguza idadi ya malengo ambayo hatimaye hufikia chombo cha mmenyuko cha PCR.
Kwa ujumla, vizuizi vya PCR vipo katika majimaji mengi ya mwili na vitendanishi vinavyotumika kwa ajili ya vipimo vya uchunguzi wa kimatibabu (urea kwenye mkojo, himoglobini na heparini kwenye damu), virutubisho vya lishe (vijenzi vya kikaboni, glycogen, mafuta, ioni za Ca2+) na vipengele katika mazingira (fenoli, metali nzito)

Vizuizi vya PCR vilivyoenea zaidi vinaweza kupatikana katika seli za bakteria na yukariyoti, DNA isiyolengwa, makromolekuli zinazofunga DNA za matrices ya tishu na vifaa vya maabara kama vile glavu na plastiki. Utakaso wa asidi ya kiini wakati au baada ya uchimbaji ndiyo njia inayopendelewa ya kuondoa vizuizi vya PCR.
Leo, vifaa mbalimbali vya uchimbaji otomatiki vinaweza kuchukua nafasi ya itifaki nyingi za mikono, lakini urejeshaji na/au utakaso wa malengo kwa 100% haujawahi kufikiwa. Vizuizi vinavyowezekana bado vinaweza kuwepo katika asidi za kiini zilizosafishwa au vinaweza kuwa tayari vimeanza kufanya kazi. Mikakati tofauti ipo ili kupunguza athari za vizuizi. Uchaguzi wa polima inayofaa unaweza kuwa na athari kubwa kwenye shughuli za vizuizi. Njia zingine zilizothibitishwa za kupunguza kizuizi cha PCR ni kuongeza mkusanyiko wa polima au kutumia viongeza kama vile BSA.
Kuzuiwa kwa athari za PCR kunaweza kuonyeshwa kwa kutumia udhibiti wa ubora wa mchakato wa ndani (IPC).
Lazima kuwe na uangalifu ili kuondoa vitendanishi vyote na myeyusho mingine kwenye kifaa cha kutoa, kama vile ethanoli, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol na fenoli, kutoka kwa kitenganishi cha asidi ya kiini kwa hatua ya kuosha kwa kina. Kulingana na ukolezi wao, wanaweza kuamsha au kuzuia PCR.